Como as sequências e tags contribuem para a expressão de proteínas

Na produção de proteínas e enzimas de interesse industrial e farmacêutico, é muito comum utilizar sistemas procariontes de expressão. 

Entretanto, em alguns organismos, como E. coli, a expressão é às vezes dificultada por propriedades bioquímicas da proteína, do padrão de uso de códons e das estruturas secundárias no transcrito. 

Além disso, é importante que o produto seja facilmente purificado e detectado ao longo da produção. 

Para contornar essas dificuldades, é possível utilizar tags, peptídeos ou proteínas que clonados in tandem ao gene de interesse são capazes de facilitar a produção, detecção e purificação da proteína. 

É importante dizer que, ainda que possam formar proteínas quiméricas, é possível separar o gene de interesse da tag, visto que podem alterar a atividade enzimática e a ligação a outras proteínas.

 

Peptídeo sinal

O peptídeo sinal pode ser considerado uma tag de localização celular. A sequência, que inicia no N-terminal, determina se a proteína se concentrará no citoplasma, periplasma, superfície celular ou se será secretada para fora da célula. A localização da proteína correlaciona com a capacidade de formação de pontes de dissulfeto Cys-Cys e aumento na qualidade conformacional, que ocorrem no periplasma, mas não no ambiente redutor citosólico. Ao secretar proteínas, é possível obter o produto com qualidade estrutural e com custos reduzidos, uma vez que a proteína é purificada diretamente do meio de cultura, sem a necessidade de lise celular.

 

Tags

C ou N terminal: Onde inserir a tag?

Ao inserir uma tag de expressão ou de solubilidade no N-terminal, como a MBP, é possível aumentar a eficiência de tradução da construção. No entanto, é importante avaliar os possíveis impactos estruturais e funcionais da tag em relação à proteína de interesse.

 

Tags de purificação e afinidade

As tags de afinidade são geralmente peptídeos com função antigênica ou quelante. Tags como FLAG são detectáveis por anticorpos e facilitam em experimentos de detecção, como Western Blotting, e purificação por cromatografia de afinidade. 

Já a Hist Tag, embora também seja detectável por anticorpos anti-His, é mais utilizada na purificação em coluna de Ni, IMAC. A His-tag desempenha um efeito quelante com o Ni da resina, ligando-se na coluna e desligando-se na presença de imidazol.

 

Tag	Tamanho	Sequência	Afinidade	Eluição
His-tag	0,8 kDa	HHHHHH	Níquel, cobalto	Imidazol, histidina, pH
FLAG	1 kDa	DYKDDDDK	Anticorpo anti-Flag	Peptídeo Flag, Clivagem, pH

 

Tags de expressão e solubilidade

As tags de solubilidade são proteínas nativas altamente expressas no sistema, como a MBP e SUMO. Ao fundi-las no N-terminal do gene de interesse, é possível aumentar a expressão, solubilidade e garantir um folding correto de uma proteína  insolúvel ou pouco expressa no sistema de expressão. 

O efeito de solubilização e de folding correto dessas tags é resultado da 1) capacidade de recrutar ou exercer o papel de chaperonas moleculares; 2) da formação de micelas; e 3) da repulsão eletrostática entre proteínas.

 

Tag	Nome	Tamanho	Origem	Expressão	Função	Mecanismo
MBP	Maltose-binding protein	43 kDa	E. coli	Periplasma	Expressão e solubilidade	Efeito chaperona
TrxA	Thioredoxin A	12 kDa	E. coli	Citoplasma	Solubilidade	Prevenção de formação de corpos de inclusão
GST	Glutathione S-transferase	26 kDa	Schistosoma japonicum	Citoplasma	Solubilidade e afinidade	Proteção contra proteólise
SUMO	Small ubiquitin-related modifier	11 kDa	Eucariotos	Citoplasma	Expressão e solubilidade	Efeito chaperona

 

Sequências de clivagem

Embora tags sejam úteis no processo de expressão e purificação, é importante que não estejam presente no produto final. É possível retirar tags por meio de clivagem enzimática de sítios de clivagem por endopeptidases, como a enterokinase, trombina, fator Xa e TEV protease.

Enzima	Sítio de clivagem
Enterokinase	LVVV
Trombina	LVPR↓GS
Factor Xa	LVPR↓GS
TEV protease	ENLYFQ↓G
SUMO protease	N-SUMO-GG↓

 

Tags de fluorescência

Proteínas fluorescentes são uma ferramenta muito útil para melhorar a visualização de estruturas e processos celulares e moleculares, além de auxiliar na detecção ao longo do processo de produção e purificação de proteínas. 

Desde a descoberta e utilização da GFP da água-viva Aequorea victoria, mais proteínas fotoativas com cores diferentes foram estudadas e otimizadas para o aumento do brilho e para compreender um amplo espectro da luz, do UV ao infravermelho.

Proteínas que absorvem no infravermelho foram derivadas do fitocromo bacteriano e são úteis para estudos in vivo. Com essas proteínas, é possível visualizar órgãos intactos em camundongos, drosófilas e zebrafish, por exemplo.

Dentre essas proteínas, estão:

 

Tags	Comprimento de onda (nm)	Cor
GFP, EGFP, Superfolder GFP	440-488	azul, ciano
TagBBFP, EBFP	350-405	violeta
Clover, NeonGreen, EYFP	488-515	verde
mRuby3, TagRFP	581	amarelo
mCherry, smURFP, mStrawberry	581-647	vermelho

 

Em resumo, as tags são importantes ferramentas na produção de proteínas e enzimas de interesse industrial e farmacêutico, em sistemas procariontes e eucariontes de expressão. 

Elas facilitam a expressão, solubilização, detecção e purificação das proteínas. O peptídeo sinal, uma tag de localização celular, determina a localização da proteína e pode ser usada para secretar proteínas diretamente do meio de cultura, reduzindo custos e aumentando a qualidade estrutural do produto. As tags de purificação e afinidade, como His-tag e FLAG, são utilizadas na purificação por cromatografia de afinidade e experimentos de detecção. As tags de expressão e solubilidade, como MBP e SUMO, aumentam a expressão, solubilidade e garantem o folding correto de proteínas insolúveis ou pouco expressas. 

Por fim, é possível retirar as tags por meio de clivagem enzimática de sítios específicos de clivagem. O uso correto e adequado de tags pode melhorar significativamente a produção de proteínas e enzimas de interesse.

 

Referências

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